Criopreservación de semen

 

 

MANEJO DEL SEMEN LUEGO DE LA OBTENCIÓN

Debe ser cuidadoso evitando el shock térmico por frío o sobrecalentamiento, la contaminación por agua, orina o agentes químicos, la excesiva agitación y la exposición al aire o la luz solar directa. Si el semen no se va a diluir dentro de las 2 horas siguientes, se lo puede dejar en un recipiente pequeño cerrado, en un lugar oscuro a temperatura ambiente.

El semen no diluido de toros fértiles puede utilizarse para IA hasta 24 - 36 hs luego de obtenido; el semen se enfría gradualmente colocando el frasco o tubo en un recipiente con agua a una temperatura cercana a la corporal 26 - 33 º C y poniendo luego ese recipiente en la heladera a temperaturas entre 3 - 8 ºC.

 

Para la IA se usa por lo general semen diluido, refrigerado o congelado, antes que semen fresco y no diluido, por las siguientes razones:

·      El semen diluido se almacena mejor y mantiene por más tiempo su fertilidad

·      Se puede fecundar más vacas con solo 1 eyaculado y más aún si se diluye.

·      Los espermatozoides están protegidos de cambios bruscos de temperaturas

·      Las soluciones buffer mantienen un adecuado pH del semen

·      Les es proporcionado nutrientes y los antibióticos alargan la viabilidad espermática, mejoran la fertilidad y controlan el desarrollo de algunas bacterias.

Antes de diluir un semen, se debe hacer un examen exhaustivo en fresco inmediatamente luego de su obtención para establecer la motilidad y concentración.

 

DILUYENTES DE SEMEN

 

 

Requisitos de un diluyente:

1. Poseer presión osmótica isotónica como la de la sangre y ser capaz de conservarla durante el almacenamiento a un nivel aproximado.

2. Proporcionar un equilibrio adecuado de elementos esenciales para la vida de las células espermáticas.

3. Aportar nutrientes que necesitan los zoospermios para el metabolismo aeróbico y anaeróbico.

4. Suministrar lipoproteínas y/o lecitinas que protejan a los zoospermios del “choque a frigore”.

5. Proveer sustancias químicas que tengan poder tampón sobre los productos finales del metabolismo cito espermático.

6. Aportar las necesarias sustancias reductoras que protegen las enzima celulares del grupo sulfidrilos (ac ascórbico)

7. Estar libres de productos o sustancias bacterianas o gérmenes que sean nocivos para los zoospermios, el aparato genital femenino, el proceso de fecundación, implantación, y desarrollo del huevo fecundado.

8. aumenten el volumen

9. Proteja a los espermatozoides en el proceso de congelación.

10. Aumente el número de dosis por inseminación

11. Evitar el desperdicio de espermatozoides

 

Dilución: es el aumento en el volumen y rendimiento del eyaculado.

Diluyente conservador: es una sustancia que aumenta el volumen y mantiene óptima la vitalidad y capacidad fecundante de los espermatozoides.

 

 

Otras clasificaciones:

Métodos extensores: aumentan el rendimiento

Métodos protectores igual que diluyen conservan

Métodos implementores: elevan en un 13 -18 % la capacidad fecundante femenina, la hialuronidasa favorece la conjugación, mientras que la oxitocina favorece la contracción uterotubárica.

 

 

DILUYENTES O EXTENSORES

Definición: compuestos químicos o conjunto de sustancias que tienen como objetivo preservar la viabilidad y fertilidad del semen, y que tienen la característica de aumentar el volumen del eyaculado (esto nos permite obtener muchas más dosis inseminantes a un reproductor).

Funciones: - Aumenta el volumen del eyaculado

- Aporta sustratos como fuente de energía para el metabolismo espermático.

- Provee un buffer contra los efectos nocivos de los cambios de pH que se producen como consecuencia del alto metabolismo de las células espermáticas.

- Protege contra los efectos nocivos de un enfriado rápido.

- Mantener constantes las presiones osmóticas y el balance electrolítico en el medio que baña a las células espermáticas, y aportar elementos que inhiban el crecimiento bacteriano.

Características: - Atóxicos

- Isotonicidad con el eyaculado

- Capacidad buffer para pH 6,5-7,5

- Capacidad para prevenir shock térmico

- Bajo costo

- Fácil preparación  

Hoy en día existen diluyentes de muy buenas características que vienen prontos para usar. Solo es necesario agregarles agua y yema de huevo como elementos aditivos.

Componentes de los aditivos:

- Agua bidestilada apirógena y estéril

 

- Sustancias buffer (para mantener constantes la osmolaridad y el pH del medio):

·      Citrato de sodio: es el más sencillo. Se usa bastante.

·      TRIS (hidroximetil amino metano): es el elemento buffer por excelencia que compone cualquier tipo de diluyente. También se usa bastante.

·      TES

·      TEST (TRIS+TES)

·      Glutamato monosódico

 

- Materiales orgánicos (previenen el shock térmico de las células espermáticas cuando comenzamos el enfriamiento):

·         Yema de huevo: por sus propiedades a través de las lipoproteínas, fosfolípidos y lecitinas, aportan protección. Deben ser huevos del día (con – de 24 hs de puesto, se los lava con agua jabonosa, se los sumerge 5 minutos en alcohol y se les saca la yema)

·         Leche: por la caseína. Debemos tener el cuidado de inactivar la lactenina de la leche porque es espermicida. Se puede usar leche larga vida en forma directa, porque en su proceso ya fue eliminado ese componente espermicida.

 

- Azúcares (fuente de energía):

·         Fructosa 

·         Glucosa

- Inhibidores del crecimiento bacteriano: *Penicilina *Estreptomicina *Lincomicina    *Tilosina   *Neomicina    *Polimixina B

 

- Sustancias diversas: *Tiamina *Ácido ascórbico *Catalasa *EDTA y Glicina 

* Amilasa *Hialuronidasa (en el pasado, algunos diluyentes traían amilasa o hialuronidasa para ayudar un poco a los espermatozoides en el momento de la perforación, pero hoy en día ya no se usan mucho).

 

En función del objetivo que va a cumplir el diluyente, podemos dividirlos en 3 grandes tipos, según el procesamiento que vamos a realizar con el material seminal: semen refrigerado y semen a temperatura ambiente (que prácticamente no se usan), y para semen criopreservado.

 

Además de todas las sustancias que ya vimos, a los diluyentes usados para la criopreservación de semen debemos agregarle los llamados AGENTES CRIOPROTECTORES. Si no los incorporamos, no vamos a tener resultados.

Función de los agentes crioprotectores: - reducir el efecto solución.

Condiciones que deben tener: - permanecer en solución cuando las temperaturas bajan a zonas sub 0.      

– no deben cristalizar cuando se forman los primeros cristales de hielo.

- deben ser efectivos en curvas de enfriamiento lento (velocidad de enfriamiento entre los 0 y los 40ºC/minuto)   

 

Pueden ser permeables (el glicerol es el más indicado cuando se trata de semen) o no permeables.                                                    

La criopreservación, es en esencia un proceso de deshidratación aplicable a todo tipo celular. Las células tienen alto contenido fíbrico, por lo tanto debemos evitar la cristalización intracelular. Para evitarla debemos deshidratar a las células aprovechando la propiedad que tienen de comportarse como membranas semipermeables, respondiendo a las diferentes concentraciones osmóticas del medio en que se encuentren.

La curva de enfriamiento usada en criopreservación de embriones es aplicable a las células espermáticas.

En función de determinadas características de las células que vamos a procesar, obtenemos una determinada curva de enfriamiento. Los linfocitos tienen una curva óptima aproximada entre los 15 y 30ºC de descenso/minuto. En función de las características de las células espermáticas, como son los coeficientes de permeabilidad celular, temperatura y relación superficie- volumen célula espermática, se comportan de manera muy similar a los linfocitos. Por lo tanto, ya estamos incorporando una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 15 a 25 o 30ºC de descenso/minuto en la temperatura.

Al manejar velocidades de enfriamiento de estas características, no necesitamos usar congeladoras automáticas, y podemos colocar la muestra en vapores de nitrógeno líquido.

 

 

Procesamiento del material seminal:

Envases: son muy variados. – Ampollas: se usaban antes. Son de vidrio, descartables, de 0,5 o 1 ml.

- Pajuelas o Pailletes: es la técnica por excelencia a nivel de campo. Pueden ser de 0,5ml o de 0,25ml.

- Minitubos: tecnología alemana similar a las pajuelas, con un volumen de 0,3 ml.

- Pastillas o Pellets: también se utiliza a nivel de campo, pero ya no tanto, porque son más difíciles de identificar.

Hoy en día, el 70% del semen que se procesa en el Uruguay usa pajuelas, y un 30% utiliza pellets.

Entre el 20 y el 50% de las células espermáticas mueren durante todo proceso de congelación-descongelación. Debido a esto, debemos partir de un semen de muy buena calidad. Esto quiere decir que debe tener como mínimo 2 cruces de movimiento de masa, con un 70% mínimo de células espermáticas con motilidad, y una buena concentración (aproximadamente 1 millón 400 por mm cúbico). Analizando la motilidad de masa, estamos deduciendo la concentración y el porcentaje de motilidad, porque la motilidad de masa está dada por 3 factores: concentración de células. Espermáticas, el porcentaje de motilidad individual, y el vigor (fuerza del movimiento de las mismas).

 

Solamente existe motilidad de masa en semen puro. Cuando evaluamos semen congelado y descongelado, diluido para aumentar el volumen, a la descongelación no existe movimiento de masa.

 

Técnica de congelación en pajuelas:

Diluyentes comerciales: Triladyl y Biociphos son los más usados.

Al Triladyl es necesario agregarle para un 20% de Triladyl, un 60% de agua bidestilada apirógena, y un 20% de yema de huevo. Luego se homogeneiza, se puede filtrar con filtro de café y queda pronto para su uso. El Triladyl incorpora en su fórmula química TRIS, fructosa, glicerol, antibióticos (Lincomicina y Polimixina). Es de origen alemán.

El Biociphos es de origen francés. Tiene la gran ventaja que no es necesario incorporarle yema de huevo porque trae un componente vegetal que es sustituto de la yema de huevo. Esto es una gran ventaja, porque la yema que se necesita, debe ser sacada de huevos del día, y a veces no es tan sencillo conseguirlos. Al Biociphos solo debemos agregarle agua bidestilada.

 

Primero debemos extraer la muestra de material seminal. Se usa principalmente vagina artificial, si el reproductor lo permite, para poder obtener una muestra de la mejor calidad posible. Lo más importante es realizar una buena excitación del animal, dejándolo montar y luego desviarle el pene 2 o 3 veces, porque esto aumenta la concentración y la motilidad de la muestra.

El diluyente que vamos a utilizar lo colocamos en un baño María a 30ºC. Luego colocamos el eyaculado en el baño junto con el diluyente durante 5 o 6 minutos para que se equilibre la temperatura. Mientras tanto realizamos la valoración del eyaculado.

Evaluamos motilidad de masa (3 cruces), motilidad individual (70%), y sacamos una muestra para hacer el contaje de las cel espermáticas y saber que concentración existe en esa muestra. Si ya vemos una buena motilidad de masa, podemos deducir que la muestra es buena para congelación.

 

Luego, le agregamos diluyente al semen con mucho cuidado y por las paredes del recipiente. Primero hacemos una dilución de 1 en 6 (para 10 cm de semen puro se le agregan 50 ml de diluyente), siempre a baño María a 30ºC. Se homogeneiza un poco y muy lentamente, y mientras hacemos el contaje de células espermáticas (en cámara de Neubauer), para determinar que volumen o grado de dilución final del eyaculado vamos a incorporar. Normalmente se manejan diluciones de 1 en 14 a 18. Entonces, un eyaculado de 10ml, lo podemos llevar con una dilución de 1 en 15 a un volumen total de 160 ml, lo que nos va a estar dando más o menos entre 300 y 320 pajuelas o dosis. Debemos asegurar que a la descongelación existan 10 millones de células espermáticas vivas con motilidad normal. Para lograr esto, debemos incorporar en la pajuela entre 30 y 40 millones de células totales.   

Luego podemos envasar las pajuelas. Hay muchos métodos, automáticos o manuales.

Las pajuelas deben ser selladas y deben llevar impreso el nombre del reproductor, un código y la fecha de la colecta, sobre todo si son para venta.

Proceso de Enfriado: Las pajuelas se colocan en unos rackets, en un número de 100, y se llevan directamente a temperatura de 5ºC poniéndolas en la heladera, y se dejan 3 horas como mínimo y un máximo de 18. Esto sirve para permitir la equilibración de las células espermáticas. Luego, las pajuelas se sacan, y se llevan a realizar la curva de enfriamiento, en una conservadora de espuma plast con nitrógeno líquido, para que estas pajuelas en los rackets queden sumergidos en los vapores de nitrógeno que están a 120ºC bajo cero. Dejamos la pajuela unos 10 o 15 minutos, y nos aseguramos que desde +5ºC a –120ºC la velocidad de enfriamiento oscile entre 15 y 30ºC/minuto. Luego se almacena en los tanques.

 

Cuando sacamos una pajuela de un tanque, debemos hacerlo rápidamente, porque en el cuello la temperatura es de unos –70 o –60ºC.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Método de dilución conservadora:

1. Dilución en estado de refrigeración (+ 5ºC) los diluyentes usuales son:
            a) método de Phillips y Lardy - a base de fosfato - yema de huevo

            b) método de Salisbury - a base de solución de citrato de Na diluida al 2,9 % (75%) + yema (5 %)

            c) a base de leche conservada (larga vida) o puede ser leche pura, la que se calienta hasta

            91-98ºC durante 10 minutos por los efectos tóxicos de las lacteninas. 

2. Conservación a temperatura ambiente: mediante el uso de estos métodos se produce un bloqueo del metabolismo seminal por la acción del diluyente con el CO2.

            a) IVT (Illinini Variable Temp)

            b) CUE (Cornell University Extender)

            c) Leche de coco.

 

Agregado de antibióticos:

Este ampliamente demostrado que el agregado de antibióticos a los diluyentes de semen aumenta la viabilidad de los espermatozoides y elimina mo. del tipo del Campylobacter (vibro fetus).

El agregado de 300 mg de sulfanilamidas por cada 100ml de diluyente Citrato de yema de huevo produce un significativo aumento en la viabilidad del semen de toro y no perjudicaba la tasa de concepción; se comprobó   también que produce una acentuada inhibición de la fructolisis.

El agregado de 1000 UI de penicilina y 1000 mg de Estreptomicina/ ml de diluyente controlan con efectividad el desarrollo bacteriano en semen, mejoran la tasa de concepción en semen de baja calidad en un 10 -15 %.

No debe usarse sulfanilamidas para diluyentes en semen congelado, los niveles altos de antibióticos pueden ser tóxicos para los espermatozoides y cantidades superiores a las recomendadas no producen ningún efecto beneficioso extra. Los antibióticos eliminan del semen bacterias del tipo de estreptococos o Estafilo, pero no eliminan C. piógenes, Brucella, Trichomonas, Micoplasmas, Pseudomonas y Listeria.

 

Tasa de dilución: La tasa de dilución de semen de toro con los diversos diluyentes se basa en la necesidad de semen de un determinado toro, el volumen del eyaculado, la concentración de espermatozoides vivos y activamente móviles

Los estándares mínimos para semen destinado a uso en IA requieren por lo menos de 500 millones de esperma por mililitro eyaculado, un índice de vigor inicial de 3 y una motilidad progresiva de por lo menos 50% de los espermatozoides.

Cada unidad de semen diluido debe poseer un mínimos de 8 millones de espermatozoides móviles/ml.

 

Una dilución de semen se basa en la siguiente formula:

 

 

 

La cantidad de esperma activo móvil del eyaculado dividido entre 8 millones es la tasa de dilución posible.

Esta tasa de dilución permite diluciones de 1:150 o 1: 200

El semen y el diluyente se deben mezclar suavemente inclinando en diversos direcciones el recipiente que las contiene; en los centros de IA el semen diluido se fracciona en frascos para impedir la agitación que es perjudicial para la dilución, estos tubos se llenan, se sellan y rotulan según el toro del que provengan.

La dilución permite servir 2 o 3 veces más vacas que con semen congelado, para el que se requieren mayores cantidades de espermatozoides por ml.

El semen refrigerado produce las mejores tasas de concepción 24 - 48 hs después de su recolección, luego declina rápidamente, especialmente luego de 4 días de almacenamiento y se produce más muertes embrionarias precoces.

El volumen utilizado frecuentemente es de 1 ml.-

 

PROCESAMIENTO DE SEMEN DE TORO

 

I) INTRODUCCION:

La utilización de semen congelado ha sido una de las mayores contribuciones al mejoramiento genético de las especies domésticas.  Es posible ahora, a través de su uso, inseminar vacas con un toro superior en cualquier parte del mundo, aún luego de su muerte.  Además, se ha hecho posible el uso de semen de toros genéticamente superiores en varios miles de vacas, mucho más de lo que alguna vez se pudo suponer con el uso del semen líquido.

 

 

Las VENTAJAS de almacenar semen a -196 grados C, en contraposición a la conservación a 5 grados, en especies donde ambas alternativas son posibles incluyen:

1. Posibilita inseminaciones selectivas, dado que el semen congelado puede ser almacenado por largos períodos de tiempo o puede ser enviado a grandes distancias.

2. Permite la creación de bancos de semen como reserva para demandas futuras, aunque estas sean usualmente más imaginarias que reales.  El macho puede ser eliminado luego de que "n" cantidad de dosis son procesadas y almacenadas.

 

Las DESVENTAJAS del semen congelado incluyen:

1. El proceso de congelado y descongelado mata por lo menos un 10% (20 a 50%) de los espermatozoos, aun empleando las mejores técnicas.

2.  Algunos toros producen semen conteniendo espermatozoos que no son altamente fértiles luego del congelado y descongelado.

3. El equipo necesario y el nitrógeno líquido son costosos.  El costo del mantenimiento de temperatura aumenta al aumentar el tiempo en el cual el semen puede ser utilizado.

4. Se necesita una mayor habilidad técnica para organizar y realizar un adecuado programa de semen congelado.

 

II) DILUYENTES.

A) Definición:

Los diluyentes son compuestos químicos, o conjunto de sustancias que preservan la viabilidad y fertilidad del semen, a la vez que posibilitan el procesamiento de un número previamente establecido de espermatozoos, acondicionados en envases adecuados, de un tamaño conveniente para la inseminación.

B) Generalidades.

La concentración de espermatozoos en un eyaculado de un toro normal, es considerablemente alta, lo que posibilita que pueda ser utilizado para inseminar cientos de vacas.  Es necesario, por lo tanto, realizar una dilución o extensión del mismo para proveer una dosis de inseminación conveniente, que contenga un suficiente número de espermatozoos de modo de asegurar un máximo porcentaje de fertilización sin desperdiciar espermatozoos.  Al mezclar espermatozoos con diluyentes (extensores), se agregan muchos ingredientes que los mantienen y protegen, preservando por lo tanto su fertilidad hasta el momento de la inseminación.

Los términos extensión y extensores son más correctos que dilución y diluyentes, dado que el material adicionado al semen extiende activamente la vida de los espermatozoos.  Sin embargo, dado que los términos dilución y diluyentes son de utilización más común, se continuarán empleando en este resumen.

 

C) Funciones de un Diluyente.

1. Proveer nutrientes a los espermatozoos, como fuente de energía.

2. Proteger los espermatozoos contra los efectos dañinos de un enfriado rápido.

3. Proveer un buffer para prevenir efectos nocivos de cambios de PH, al formarse ácido láctico, resultante del metabolismo de la glucosa por los espermatozoos.

4. Mantener una presión osmótica y un balance electrolítico adecuado.

5. Inhibir el crecimiento bacteriano.

6. Aumentar el volumen de semen de modo que pueda ser utilizado para múltiples inseminaciones.

7. Proteger los espermatozoos del congelado.

 

D) Tipos de Diluyentes.

a) Generalidades.

Hay incontables medios que preservan el espermatozoo:

- soluciones salinas fisiológicas

- glucosa

- sulfatos, etc.

- lecitinas y peptonas que también pueden proteger la membrana lipídica del espermatozoo

Ninguno de estos medios, sin embargo, extienden la vida de los espermatozoos.

El mayor avance en diluyentes de semen surgió con el descubrimiento de la yema de huevo (1939) [así como el mayor avance en la congelación de semen surgió con el descubrimiento del glicerol (1949).

En la fórmula original, el diluyente contenía volúmenes iguales de yema de huevo y fosfato bufferado.  Luego se descubrió que si se reemplazaba el fosfato por citrato de sodio se mantenía la misma fertilidad, a la vez que mejoraba la motilidad y la visibilidad (lo que hacía posible una mejor evaluación microscópica).

Dada la gran variedad de diluyentes existentes, cada laboratorio (o cada profesional especializado) debe determinar qué diluyente, bajo sus condiciones, provee un máximo de eficiencia reproductiva.

 

b) Componentes Básicos de un Diluyente.

1) Agua Destilada. Actúa como solvente para los componentes semanales y del diluyente.

 Debe ser destilada (o mejor bidestilada) para eliminar la presencia de metales pesados en solución, que son dañinos para el espermatozoo.

2) Sustancias Buffer y no iónicas. (Disueltas para mantener la osmolaridad y el PH del medio).

          Entre éstas se encuentran:

-      Citrato de Sodio (dihidrato)

-      TRIS

-      TES

-      TEST (TRIS + TES)

-      Glutamato Monosódico

-      Diferentes buffers con combinaciones de soluciones salinas o carbohidratos

-      Preparaciones a base de leche

3) Materiales orgánicos.    Tienen la capacidad de prevenir el shock de frío (yema de huevo o leche).

Concentraciones de aproximadamente 20% de YEMA DE HUEVO son comunes en la mayoría de los diluyentes.  La yema de huevo actúa previniendo el shock de frío a través de sus constituyentes:

    Lipoproteínas, fosfolípidos y lecitinas.

   En el caso de la LECHE (que puede ser entera o descremada), la caseína es la sustancia responsable de la protección contra el shock de frío.

Cuando se utiliza leche en un diluyente, ésta debe ser calentada por encima del punto de pasteurización, para destruir la lactenina que es espermicida (los grupos sulfóxido liberados al calentar la leche, probablemente eliminan este factor tóxico).  El procedimiento adecuado consiste en calentar la leche hasta 92 o 95 grados por 10 minutos, dejándola enfriar y repitiendo la operación un par de veces más (tyndalización).

A los efectos prácticos, puede ser utilizada la denominada "leche de larga vida" o leche en polvo reconstituida, ya que el

Proceso de preparación de ambas incluye un calentamiento adecuado para la destrucción de la lactenina.

4) Agentes crioprotectores.

El glicerol es el agente crioprotector más comúnmente usado.  La concentración varía con el diluyente utilizado y el modo de congelación.  Otro agente crioprotector es el di-Metil Sulfóxido (DMSO), aunque no es utilizado generalmente en los diluyentes para semen.

5) Azúcares.

Los monosacáridos (Glucosa y Fructosa) son azúcares de los cuales el espermatozoo puede obtener energía para sus procesos vitales.  También actuaran como sustitutos de electrolitos, manteniendo el balance osmótico del diluyente.

Di y Trisacáridos, los cuales no pueden ser metabolizados por el espermatozoo, proporcionan algo de acción crioprotectora, principalmente como moléculas relativamente grandes que contribuyen a mantener un balance osmótico, actuando como sustitutos de electrolitos.  No son capaces de penetrar la membrana espermática y probablemente disminuyen los efectos de la concentración de solutos durante la congelación y la descongelación.  Proporcionan mejores resultados cuando se agregan al semen en la fracción glicerolada antes de la congelación y no están presentes en la primera fracción del diluyente.  Para el congelado de pellets (pastillas), donde la tasa de congelado es rápida, estos azúcares reemplazan efectivamente las sales bufferado de los diluyentes.

6) Aditivos.   Tales como algunas enzimas, pueden mejorar la fertilidad.

7) Antibióticos. Para controlar el crecimiento de microorganismos.  Los más utilizados son Penicilina y Estreptomicina.

 

PRINCIPIOS DE PRESERVACION

Los requerimientos de los espermatozoos son, primariamente, para el mantenimiento de las funciones vitales para sobrevivir, incluyendo energía para su motilidad.

Los espermatozoos deben estar vivos para ser fértiles y la motilidad ha sido utilizada para determinar la viabilidad.  La motilidad es, sin embargo, un reflejo de la actividad flagelar y no necesariamente garantiza que esa célula sea fértil.  La integridad del material genético en la cromatina del espermatozoo también debe ser preservada para lograr un desarrollo embrionario normal luego de la fertilización.

 

1) Temperatura: La actividad metabólica es proporcional a la temperatura absoluta, de modo que la disminución de ésta es el mecanismo principal para enlentecer las reacciones químicas y prolongar la vida de las células (los espermatozoos consumen 42 veces más oxígeno a 37 grados que a 5 grados).

Al mismo tiempo que la temperatura disminuye, ocurren cambios en el ambiente interno y externo del espermatozoo.  La solubilidad de los gases en el ambiente externo aumenta: la del 02 se duplica y la del C02 se triplica.  Esto permite que una mayor proporción de la actividad metabólica total sea realizada a través de un metabolismo oxidativo.

Los espermatozoos son eyaculados a temperatura corporal.  Pueden ser mantenidos por un corto período a esa temperatura, en un medio adecuado, pero mueren rápidamente cuando ésta excede los 46 grados C.

Los espermatozoos pueden ser enfriados por debajo de la temperatura corporal, con la mencionada disminución de la actividad metabólica y sin que sufran daños detestables.  Sin embargo, si son enfriados a 5 grados C sin un medio protector, sufren un shock de frío (ver más adelante).

 

2) Energía: El requerimiento principal de energía del espermatozoo es para mantener la motilidad, pero se requiere energía adicional para el mantenimiento celular.  Los espermatozoos tienen capacidad tanto de metabolismo aeróbico como anaeróbico.  Una simple fuente de energía, como fructosa o glucosa (que son capaces de penetrar al espermatozoo) se debe adicionar al diluyente para proteger las reservas intracelulares del espermatozoo (la fructosa presente en el plasma seminal se diluye considerablemente con la extensión). En ausencia de un sustrato simple como los mencionados, los espermatozoos pueden oxidar fosfolípidos intracelulares, lo que resulta nocivo para la célula.  La yema de huevo y la leche contienen glucosa así como otros componentes utilizados por el espermatozoo.

 

3) Osmolaridad: La osmolaridad (número de partículas suspendidas como solutos en una solución) influencia no solamente la presión osmótica de una solución, sino el punto al cual el solvente se congela.  Por lo tanto, la disminución del punto de congelación de una solución refleja su concentración osmolar.  Una concentración osmolar de un soluto en agua disminuye su punto de congelación 1,86º C. La depresión del punto de congelación del semen de toro es aproximadamente - 0, 55 grados C, equivalente a una concentración de + 300 miliosmoles, que aumenta cuando el espermatozoo metaboliza nutrientes.  Por lo tanto, es preferible errar hacia el lado de la hipotonía que el de la hipertonía en un diluyente.

Los espermatozoos se comportan como osmómetros y son capaces de grandes cambios de tamaño, dependiendo de la tonicidad del medio en que se encuentran.  El plasma seminal tiene una presión osmótica de 285 miliosmoles y se asume que representa la presión osmótica ideal.  Aún en ese caso, no debe asumirse que soluciones de presión osmótica equivalente, medida por pruebas físicas, sean isotónicas con el espermatozoo, ya que la permeabilidad de la célula a diferentes sustancias varía.  Pueden haber interacciones entre la concentración total de sustancias en el líquido que rodea al espermatozoo, el pH del medio, iones específicos y electrolitos presentes.  Si la tonicidad del medio se desvía considerablemente, los espermatozoos pueden mostrar colas dobladas, nadar en círculos y morir.  Afortunadamente, los espermatozoos pueden tolerar una variación moderada de tonicidad sin perder fertilidad.  El grado de tolerancia está afectado por interacciones con el PH y otros iones presentes.  Los diluyentes elaborados para preservar el semen deben ser isotónicos bajo las condiciones de su empleo para no causar daños morfológicos o funcionales.

 

4) Buffers y pH: Los espermatozoos necesitan ser protegidos contra una autointoxicación debido a productos ácidos (ácido láctico) derivados de su metabolismo.

La motilidad y fertilidad se preservan bien en yema de huevo y leche con PH neutro, aunque una reducción del pH a 6,5 puede resultar beneficioso.

 

5) Inhibición del Crecimiento de Microorganismos: La yema de huevo, así como otros medios, proporcionan un buen ambiente para el desarrollo de microorganismos, los que a su vez producen productos que pueden ser dañinos para los espermatozoos y que pueden infectar las hembras.  Algunos organismos se encuentran en el semen de toros sanos aún en condiciones asépticas de colección y procesamiento.  Es, por lo tanto, una práctica común y adecuada, incluir antibióticos tales como penicilina y estreptomicina en los diluyentes.

 

6)Exclusión de Materiales Tóxicos : Los diluyentes deben ser formulados no solamente de manera que prevengan la formación de productos tóxicos durante el almacenamiento, sino que además deben estar libres de sustancias que puedan ser dañinas para los espermatozoos, tales como metales pesados, de modo que debe emplearse siempre agua destilada.  Agentes crioprotectores como el glicerol son algo tóxicos y espermatozoos muertos son una fuente de aminoácido oxidasa, que es dañina para las células a través de la producción de H202.

 

7)"Efecto Diluyente”: La dilución de espermatozoos, particularmente en medios sintéticos, declinan su motilidad en una relación directa a la tasa de dilución.  Las causas de este "efecto de dilución" parecen ser debidas a una pérdida de componentes del espermatozoo en presencia de un medio muy diluido.  Por otra parte, el semen debe ser mezclado con una cantidad suficiente de diluyente de manera que la concentración inicial de espermatozoos sea diluida hasta llegar a un número deseado de espermatozoos en una dosis inseminante. 

Se deben agregar, por lo tanto, agentes protectores tales como macromoléculas presentes en productos naturales así como yema de huevo o leche, para así reducir o eliminar este "efecto".

 

8) Protección de los Espermatozoos Contra el Frío.

Cuando los espermatozoos son enfriados a 5 grados C., están sujetos a un shock de frío que afecta la membrana plasmática y causa la pérdida de enzimas intracelulares, lipoproteínas, potasio, ATP y otros materiales de las células.  Más aún, la motilidad disminuye y las colas se pueden doblar.  Si los espermatozoos son enfriados lentamente, especialmente por debajo de 20 grados, el daño es menos severo, lo que indica que ocurren cambios internos y externos a un ritmo que permite a la célula ajustarse a la caída de temperatura.  El medio más efectivo de proteger a los espermatozoos contra los efectos del enfriamiento es proveerlos con lecitina, proteínas, lipoproteínas y compuestas similares presentes en la yema de huevo o leche.

 

PRINCIPIOS Y TECNICAS PARA LA CONGELACION DEL SEMEN

 

El agua es el principal constituyente de los fluidos biológicos responsables para el transporte interno de productos químicos esenciales.  El agua pura se congela y forma cristales a 0 grado, mientras que el agua conteniendo iones y otras sustancias en solución se congela a temperaturas más bajas, dependiendo de la concentración de esas sustancias.  Cuando el agua en una solución se congela, se forman cristales de agua pura dejando atrás mayor concentración de esas sustancias en la solución.  Esto aumenta la presión osmótica del soluto remanente, lo que puede dañar a las células.

El glicerol protege a los espermatozoides de esos problemas.

1)  Aspectos Teóricos del Congelado y Descongelado.

     a) Consecuencias físicas y químicas:

Por lo menos 50% de los espermatozoos mueren o pierden motilidad durante el congelado y descongelado.

El daño se causa por:

1) Formación de cristales de hielo intracelulares que afectan la estructura del espermatozoo.

     2) Concentración de solutos que resulta cuando el agua pura abandona la suspensión tanto dentro como fuera de la célula.

3) Por interacciones de estos dos fenómenos físicos.

Las principales consecuencias físicas y químicas del congelamiento son la remoción del agua pura de la solución    al formarse cristales de hielo con el resultante aumento de concentración de solutos en el líquido residual Estos eventos y sus consecuencias en las células, están influenciados por:

- los niveles y tipos de agentes crioprotectores,

- la osmolaridad,

- el PH del diluyente y

- la tasa de congelación.

El punto de congelación de una solución está dado por la concentración de partículas que contiene como solutos.

Cuando una solución se enfría, y pasado el punto en el cual se forman los cristales de hielo, tiene lugar una continua serie de eventos.  La tasa de enfriado depende de la diferencia de temperatura entre la solución y su líquido refrigerante y su masa relativa.  Dependiendo de la concentración de solutos y la tasa de enfriamiento, la temperatura de la solución cae por debajo del verdadero punto de congelación del agua hasta que se forma un cristal de hielo alrededor de la célula.  A ese punto, el calor de fusión requerido para formar hielo debe ser removido de la solución de modo que la temperatura sufre una elevación.  Mientras que cada molécula de agua pura de la solución se congela, la concentración de partículas en la que permanece aumenta, resultando en una continúa caída del punto de congelación de la solución.  Estos cambios interrelacionados continúan hasta que todo el solvente con sus solutos y otros compuestos hayan completado el proceso a través del "punto eutéctico" (mezcla de cuerpos sólidos cuya fusión se realiza a una temperatura constante como la de los cuerpos puros).  Debido a una más larga exposición de las células, los efectos dañinos de la alta concentración de solutos son más críticos con bajas tasas de congelación.  Similarmente, d (-I) ido -i que las células deben ser expuestas a concentraciones de soluto dañinas durante el descongelado, éste debe ser rápido.

La formación de cristales extracelulares no es una causa primaria de daño espermático durante la congelación.  La formación de cristales intracelulares, sin embargo, es letal.

El aumento de concentración de solutos, ocasionado cuando el agua se congela parece ser la principal causa de daño celular.  La concentración de solutos, la velocidad de cambio y los efectos dañinos en el espermatozoo dependen de la temperatura y su tasa de cambio.

Durante un congelado lento, las células están expuestas por períodos prolongados a concentraciones de solutos que están aumentando relativamente despacio y puede ocurrir deshidratación celular.

Durante un congelado rápido, la duración de la exposición a una aumentada concentración de solutos se reduce y la deshidratación celular se puede evitar.

El aumento de presión osmótica del medio de suspensión que acompaña el congelamiento, saca agua de dentro de la célula, aumentando la concentración intracelular de electrolitos.  En contraste, congelamiento rápido, como el obtenido por inmersión directa en nitrógeno líquido resulta en la formación de un número relativamente grande de pequeños cristales tanto dentro del espermatozoo como en el medio de suspensión.  El hielo intracelular se puede formar durante el congelamiento rápido porque hay un tiempo insuficiente para que toda el agua congelable difunda de la célula.  Tanto el congelamiento rápido como el lento causan daño celular, aunque por diferentes mecanismos.

b) Función del Glicerol:

El glicerol se une a la molécula de agua y baja el punto de congelación de las soluciones, por lo que en su presencia se forma menos hielo a cualquier temperatura dada.  De esta manera, se reduce la concentración de solutos en el líquido residual.

La influencia dañina de la concentración de solutos depende, aparentemente, de la temperatura.  Por lo tanto el glicerol, al reducir la temperatura a la cual se llega a una determinada concentración de solutos, reduce estos efectos dañinos.

En soporte de este concepto, el nivel óptimo de glicerol de un diluyente aumenta a medida que la tonicidad del diluyente aumenta.

   El glicerol probablemente deshidrata las células y forma complejos con los iones metálicos.

El glicerol penetra rápidamente el espermatozoo vivo en suspensión, siendo oxidado por éste y se concentra en la parte posterior de la cabeza.

Para ser más efectivo, el glicerol requiere una tasa de congelación relativamente baja.

 

 

CONGELACION DE SEMEN DE TORO

I) CONSIDERACIONES FISICAS DE LA CONGELACION.

A.- PROCESO DEL CONGELADO

La congelación de semen presenta varios problemas, incluyendo el shock por frio, daño por la formación de cristales de hielo y cambios provocados por la deshidratación asociada a la formación de cristales de agua .El congelado es esencialmente un proceso de desecación .Cuando una suspensión de espermatozoides es enfriada por debajo de 0 grado, el primer paso es la formación de cristales de hielo extracelulares, la concentración de solutos en el agua extracelular aumenta. Inicialmente, el agua intracelular no se congela, pero es "superenfriada" por debajo del punto de congelación.  Debido al aumento de concentración de solutos extracelulares, el agua se mueve de dentro del espacio extracelular.

A medida que el agua sale de la célula para congelarse, la célula se deshidrata.

Si el agua no puede abandonar la célula lo suficientemente rápido, se forman cristales de hielo intracelulares

Estos cristales dañan el espermatozoide, mientras que los cristales extracelulares no causan daño irreversible.

Si el proceso de enfriado es muy lento, la concentración de solutos intracelulares, deshidratación, precipitación de solutos y cambio de PH, pueden ocasionar daños. Si el enfriado es muy rápido se forman cristales intracelulares .La tasa (velocidad) optima de congelado es un compromiso entre estos 2 puntos.

 

B.- ACCION DE LOS AGENTES CRIOPROTECTORES.

Los agentes crioprotectores penetran la célula (glicerol, DMSO) o no son penetrantes .El glicerol penetra rápidamente la célula como un no- electrolito y se une al agua intracelular y por lo tanto, reduce la concentración intracelular de solutos a cualquier temperatura dada.  Aunque esto puede ser el modo de acción, la mayor motilidad al descongelado se obtiene con una exposición al glicerol de solamente 10 segundos antes del congelado. Consecuentemente, debe haber una indeterminada acción extracelular del glicerol.

Clásicamente, el semen de toro diluido es enfriado a 5 grados, se le agrega glicerol y luego se deja un intervalo de 1 a l0 horas para "equilibración".  En un comienzo se pensó que esta etapa era necesaria para permitir la entrada de glicerol a la célula y completar así su acción protectora.  Posiblemente, el efecto de esta equilibración se deba más a un acostumbramiento de la célula a temperaturas bajas previo al congelado.

Aunque el glicerol es esencial para el congelado del semen, también puede afectar adversamente la membrana celular y volver al espermatozoo infértil, aunque la motilidad al descongelado se mantenga.

 

II) PROCESAMIENTO.

1. TIPOS DE ENVASES:

a) Ampollas.  Consiste en ampollas de vidrio, de 1 cm de capacidad.  Fue el primer método de envasado de semen para congelar; actualmente no se utiliza debido a su mayor costo.

b) Pajuelas (Paillettes) - Existen básicamente tres tipos de pajuelas:

- La pajuela francesa o convencional (de Cassou), de 113 mm de largo y un volumen de 0.5 cc. (Es la más común)

- La mini pajuela, de igual largo que la anterior pero de 0,25 cc de volumen

- La”Minitub" de origen alemán. Que consiste en una pajuela de aproximadamente la mitad de largo que las anteriores y un volumen de 0.25 cc.

c) Pellets o pastillas: Es la forma más económica de procesamiento de semen, así como la de conservación, ya que ocupa mucho menos espacio que las pajuelas o ampollas.  También es la forma más común de congelación de semen de toro en Uruguay.  La crítica más común que se 1e realiza a este tipo de procesamiento es la dificultad para la identificación.

 

2) SEMEN:

A - Se debe utilizar solamente semen de buena calidad.  Es preferible el semen obtenido por vagina artificial al obtenido por electroeyaculación, dado que la concentración espermática es generalmente más alta. Aunque de calidad más variable, el semen colectado por electroeyaculación puede congelarse sin problemas, y su fertilidad es tan buena como la del semen obtenido por vagina artificial.

B - Una vez colectado, el semen debe ser manipulado con cuidado para Fiar shock térmico y diluido utilizando procedimientos adecuados...

 

C - Evaluados conteniendo menos de 50% de espermatozoos móviles o más de 30% de espermatozoos anormales deben ser descartados, aunque en algunos casos especiales podría ser congelado.

 

D - Cada dosis de inseminación debe contener por lo menos 10 millones de espermatozoos móviles luego del congelado y descongelado.  Por lo tanto, el semen generalmente se procesa para que contenga en total entre 30 y 50 millones de espermatozoos por dosis o 20 a 30 millones de espermatozoo móviles antes del congelado.

 

3. PROCESAMIENTO EN PAJUELAS.

A los efectos de simplificar esta recopilación, considerará solamente la pajuela "de Cassou", de 0. 5 cc de volumen.)

 

A. CALCULO DE DILUCION.

1. Determinar la concentración.

  La concentración de semen se puede calcular por contaje en cámara cuenta glóbulos, realizando una dilución del semen de l: 100 o mediante el empleo de un espectrofotómetro previamente calibrado,

2 .Determinar el Número de Dosis que se pueden obtener.

Información necesaria:

a) Total de espermatozoos del eyaculado (Volumen x Concentración).

b)-Número de espermatozoos deseados por dosis.

Dividiendo a/b, se obtiene el número de dosis.

3.- Determinar el volumen de diluyente requerido.

Información necesaria:

a)       Número de dosis

b)      Volumen por dosis

c)       Volumen de semen

 

Multiplicando a x b se obtiene el volumen total de semen diluido Restando a ese total el volumen de semen, se obtiene el volumen de diluyente necesario

 

Ver técnica de Pellets en libros.

 

Descongelamiento de dosis de semen: Va a depender del envase que estemos utilizando.

*Pajuelas de 0,5 y 0,25 ml: Baño María a 35ºC durante 40 segundos.

*Ampollas de vidrio: Baño de agua con hielo a 5ºC durante 6 a 10 minutos

* Minitubos: Baño María a 39 o 40ºC durante 6 a 12 segundos

* Pellets o pastillas o píldoras de semen: previamente debemos reconstituir su volumen con suero fisiológico o citrato de sodio (al 2,9%) a 35 o 37ºC antes de recibir el pellets.

Este método a nivel de campo trae complicaciones.

 

Nunca deben utilizarse métodos incorrectos de descongelación como colocar las pajuelas debajo de la axila, en el bolsillo, dejarla al aire o ponerla en la boca (porque la temperatura no va a ser homogénea a lo largo de toda la pajuela).

Tampoco es conveniente descongelar más de 2 dosis a la vez, o demorar en realizar la inseminación.

Es necesario hacer un adecuado manejo del tanque de nitrógeno, y asegurarnos que este tenga como mínimo unos 12 cm de nitrógeno líquido medidos por regla.

Hacer un correcto montaje de la pistola de inseminación (que es más gruesas que las de transferencia), y también una buena técnica de inseminación y en el momento correcto.

Para el éxito de una inseminación artificial el semen debe ser de buena calidad sanitaria, calidad biológica, calidad bacteriológica y correctamente identificado.

Calidad sanitaria: el semen debe estar libre de agentes patógenos transmisibles por el semen, o sea, de enfermedades venéreas. Debemos realizar 4 raspajes prepuciales con un intervalo de 10 o 15 días entre cada uno, y me deben dar negativos a Campylobacter y Trichomonas.

Hay sociedades que exigen además que el toro esté libre de IBR para poder procesar y comercializar su semen.

Calidad bacteriológica: el semen es testigo indirecto de la calidad higiénica del establecimiento y del Veterinario que congeló las dosis.

Calidad biológica: es la que da el poder fecundante al material seminal. Va a ser dependiente del número de espermas con movimiento rectilíneo.

 

Se necesitan 10 millones de espermas con movimiento rectilíneo uniforme a la descongelación para lograr un buen poder fecundante luego de la inseminación.

El DILAVE permite poner 6 millones.

 

Evaluación del semen: Descongelamos 1 a 3 dosis, y evaluamos bajo el microscopio (entibiar la porta). Se analiza el porcentaje de espermatozoides con movimiento progresivo rectilíneo uniforme, y se debe aceptar un mínimo de 30 a 35% vivas a la descongelación. También se analiza el vigor, que es una medida de la fuerza de movimiento de la célula espermática. Existe una escala que va de 0 (cel de poco movimiento) a 5 (motilidad progresiva muy rápida con vibración de cabeza). Un vigor de 2 o 3 para arriba es lo aceptable.

Morfología:

 

Test de termoresistencia: Esta prueba tiene una muy buena correlación con el porcentaje de no retorno cada vez que se usa ese semen para inseminar. Se saca la muestra de una pajuela, se coloca en un tubo de ensayo a baño María a 37ºC durante 5 horas.

Si sacamos una muestra de semen congelado o no, y vemos que a la descongelación, el porcentaje de células con movimiento rectilíneo es de un 50%, luego ponemos este cultivo a 37ºC durante 5 horas.

Existe una correlación entre el porcentaje que se obtiene después de la incubación y la tasa de no retorno.

Si a las 5 horas obtenemos un 25% de células con movimiento rectilíneo, se correlaciona con un 77% de tasa de no retorno.

5%-57% no retorno

10%-66% no retorno

15%- 72% no retorno

20%- 75% no retorno

Entre un 10 y un 20% estamos bien.

Hoy en día este test se hace a temperatura de laboratorio y durante 2 horas. Al culminar este periodo, debe haber la mitad o más de espermatozoides con motilidad normal para decir que ese semen es bueno para inseminar.

 

Las partidas se califican como: -apta para inseminación artificial

- no apta para inseminación artificial

- cuestionable: si la vamos a usar debemos hacerlo con mucha cautela. No se puede comercializar.

 

El DILAVE propone tener un mínimo de 6 millones de células viables a la descongelación, con un mínimo de un 35% de células con movimiento rectilíneo uniforme, y desde el punto de vista morfológico, un máximo de 30% de anormalidades totales con no más de un 15% de anomalías mayores.

Todo semen que ingresa al país debe pasar por el DILAVE.

Muchas muestras de semen nacional han sido eliminadas debido a que están mal identificadas. Este problema se acrecienta con la utilización de Pellets.

Es muy importante asegurarse que al utilizar el semen congelado, no estemos propagando enfermedades. 

 

Texto: Javier López